Principer för nukleinsyrasyntes

Nukleinsyrasyntesen utförs med hjälp av fastfas sialinamidtriglyceridmetoden, varvid 3'-änden av DNA:t immobiliseras på ett fastfassubstrat och nukleotider tillsätts i 3'- till 5'-riktningen tills det önskade DNA-fragmentet syntetiseras .Detta skiljer sig från DNA-syntes genom applicering av DNA-polymeras.

3'-änden av den första basen immobiliseras på CPG under syntes, 5'-OH av nästa bas skyddas med di-p-tolyl trityl DMT, aminogruppen på basen skyddas med bensoesyra och 3' -OH aktiveras sedan med en aminofosfatförening.1 bas av 5 5'-OH av 1 bas och 3'-OH av nästa bas bildar en fosfittriglycerid, som sedan oxideras med jod till en fosfattriglycerid, skyddsmedlet på den andra basen 5'-OH avlägsnas med tillsats av diklorättiksyra DM cykler genom tillsatsen av nästa bas, och efter syntes avlägsnas skyddsmedlet på 5'-OH med en svag syra. Fragmentet kopplas bort från det fasta hartset med koncentrerad ammoniumhydroxid, skyddsmedlet avlägsnas från basen med koncentrerad ammoniumhydroxid under upphettning avlägsnas ammoniumhydroxiden, fragmentet vakuumtorkas och nukleinsyran renas genom vätskekromatografi eller PAGE.

Steg av oligosyntes

Avblockering

De5-ändens DMT-skyddsgrupp tas bort genom att tillsätta TCA-lösning.

Aktivering

Blandning av aktivatorn med oligonukleotidmonomeren för att bilda den aktiva oligonukleotidmonomermellanprodukten.

Koppling

Den 5-terminala hydroxylgruppen reagerar med den aktiva oligonukleotidmellanprodukten i en antigenerativ kondensationsreaktion för att bilda en instabil fosfittriglyceridbindning.

Övertäckning 

Tillsatsen av ett täckmedel utför en acetyleringsbegränsande reaktion med överskott av hydroxylgrupper som inte är involverade i kondensationsreaktionen.

Oxidation 

Tillsatsen av jodlösning innehållande vatten reagerar med instabila fosfitbindningar genom oxidation för att bilda stabila fosforsyratriglyceridbindningar.

Cyanoetylklyvning

Nukleinsyraprodukten efter syntes, med tillsats av DEA-lösning för att avlägsna cyanoetylgruppen från fosfattriglyceridbindningen.

Klyvd&Avskydd

Nukleinsyrafragmenten klyvs från fastfasbäraren genom tillsats av en koncentrerad ammoniumhydroxidlösning och upphettas sedan för att avlägsna skyddsgrupperna från basernas vätebindningar.